建立PCR反應(yīng)體系時(shí)需注意的幾個(gè)問(wèn)題
點(diǎn)擊次數(shù)：2304 更新時(shí)間：2020-11-09
PCR鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，也稱(chēng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是一種體外酶促合成特定DNA片段的方法。它由幾個(gè)反應(yīng)組成，如高溫變性、低溫退火和在合適溫度下延伸，這些反應(yīng)在循環(huán)，進(jìn)行，以便能夠快速擴(kuò)增目標(biāo)DNA。它具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡(jiǎn)單、省時(shí)的特點(diǎn)。
建立PCR反應(yīng)體系時(shí)需注意的幾個(gè)問(wèn)題
首先要說(shuō)的是Taq酶，其特征是5`→3`DNA聚合酶活性，缺乏5`→3`核酸外切酶活性，在70-75攝氏度時(shí)活性較高。在典型的聚合酶鏈反應(yīng)中，當(dāng)總反應(yīng)體積為100微升時(shí)，需要約2.5微升Taq酶。需要注意的是，使用的酶量太高，不會(huì)引起非特異性擴(kuò)增，而當(dāng)酶量太低時(shí)，合成產(chǎn)物的量會(huì)減少。
第二要注意的是dNTP的質(zhì)量和濃度。脫氧核糖核酸的質(zhì)量和濃度與聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增效率密切相關(guān)。在PCR反應(yīng)中，dNTP一般應(yīng)為50 ~ 200 umol/L，濃度過(guò)低會(huì)降低PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量，dNTP可以與Mg2結(jié)合降低游離Mg2的濃度。四種dNTP的濃度應(yīng)該相等(如摩爾制劑)，如果其中任何一種不同于其他種類(lèi)(高或低)，就會(huì)造成不匹配；dNTP保存不當(dāng)，使其不穩(wěn)定，不活躍。少量包裝，在-20攝氏度冷凍。反復(fù)凍融會(huì)降解dNTPdNTP溶液呈酸性，應(yīng)配制成高濃度，然后用1M NaOH或1M Tris-HCl緩沖液調(diào)節(jié)pH值至7.0 ~ 7.5。
第三、模板的數(shù)量。在一般的聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增中，104到107個(gè)模板分子可以獲得滿(mǎn)意的結(jié)果。
第四、Mg2濃度，一般PCR反應(yīng)中，當(dāng)各種dNTP濃度為200umol/L時(shí)，Mg2
濃度一般為1.5 ~ 2.0 mmol/L，Mg2濃度過(guò)高，反應(yīng)特異性降低，出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增。濃度過(guò)低，Taq DNA聚合酶活性降低，反應(yīng)產(chǎn)物減少。
后，引物是聚合酶鏈反應(yīng)特異性反應(yīng)的關(guān)鍵，聚合酶鏈反應(yīng)產(chǎn)物的特異性取決于導(dǎo)入
DNA與模板的互補(bǔ)程度。為了保持尹武，的完整性，應(yīng)避免反復(fù)凍融。
當(dāng)然要特別注意加入的水，一個(gè)是ph，一個(gè)是純度。
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